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比(bǐ)色(sè)法蛋(dàn)白質定量

       蛋(dàn)白質通常(cháng)是多種(zhǒng)蛋(dàn)白質(zhì)的化合物(wù)，比色法測定(dìng)的(dí)基(jī)礎(chǔ)是蛋白質構(gòu)成(chéng)成分(fēn):氨基酸(suān)(如(rú)酪氨酸(suān)，絲氨(ān)酸(suān))與外(wài)加的顯(xiǎn)色基團或(huò)者(zhě)染(rǎn)料(liào)反應，產生(shēng)有色物(wù)質(zhì)。有色物質(zhì)的濃(nóng)度與蛋(dàn)白(bái)質反應的(dí)氨(ān)基(jī)酸(suān)數目(mù)直(zhí)接相關(guān)，從(cóng)而(ér)反(fǎn)應蛋(dàn)白(bái)質(zhì)濃度。

比色方(fāng)法一般(bān)有(yǒu)BCA，Bradford，Lowry 等幾種(zhǒng)方(fāng)法(fǎ)。

        Lowry 法:以早(zǎo)期的(dí)Biuret 反(fǎn)應(yīng)為(wéi)基(jī)礎(chǔ)，並(bìng)有所改進。蛋(dàn)白質與Cu2 反(fǎn)應，產生(shēng)藍色(sè)的反(fǎn)應(yīng)物(wù)。但(dàn)是(shì)與Biuret 相(xiāng)比(bǐ)，Lowry 法敏(mǐn)感性更(gēng)高。缺點是(shì)需要(yào)順序(xù)加入幾種(zhǒng)不(bù)同的反(fǎn)應(yīng)試劑;反應需要的時間(jiān)較長(cháng);容(róng)易受到(dào)非蛋白物質的影響;含(hán)EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等(děng)物(wù)質的蛋白(bái)不適合(hé)此種方(fāng)法。

       BCA(Bicinchoninine acid assay)法:這是(shì)一(yī)種較新的，更敏感(gǎn)的(dí)蛋(dàn)白測試法。要(yào)分析(xī)的(dí)蛋白(bái)在鹼(jiǎn)性(xìng)溶液(yè)裏(lǐ)與(yǔ)Cu2 反應產生(shēng)Cu ，後(hòu)者與BCA形(xíng)成(chéng)螯(áo)合物，形(xíng)成紫色(sè)化(huà)合物，吸收峰在562nm波長。此(cǐ)化合物(wù)與(yǔ)蛋(dàn)白(bái)濃度(dù)的(dí)綫(xiàn)性(xìng)關係*，反應後(hòu)形(xíng)成的化(huà)合物非常穩定。相對(duì)於Lowry法，操(cāo)作簡(jiǎn)單，敏感(gǎn)度高(gāo)。但是與Lowry法相似(sì)的(dí)是容(róng)易(yì)受到蛋(dàn)白質(zhì)之間(jiān)以及(jí)去汙(wū)劑的(dí)幹(gān)擾(rǎo)。

       Bradford 法(fǎ):這種(zhǒng)方(fāng)法(fǎ)的(dí)原(yuán)理(lǐ)是蛋白質與考馬斯亮蘭結合(hé)反應(yīng)，產生(shēng)的有(yǒu)色(sè)化(huà)合物(wù)吸收(shōu)峰595nm。其zui大(dà)的特(tè)點(diǎn)是(shì)，敏感(gǎn)度好(hǎo)，是Lowry 和BCA 兩(liǎng)種(zhǒng)測試(shì)方(fāng)法的2 倍;操作更簡單，速(sù)度(dù)更快;隻(zhī)需要(yào)一種(zhǒng)反(fǎn)應試(shì)劑;化合(hé)物可以(yǐ)穩(wěn)定1小時(shí)，方(fāng)便(biàn)結(jié)果(guǒ);而且與(yǔ)一係列幹擾Lowry，BCA 反應(yīng)的(dí)還(huán)原(yuán)劑(jì)(如(rú)DTT，巰(qiú)基(jī)乙(yǐ)醇(chún))相(xiāng)容。但(dàn)是(shì)對(duì)於去汙(wū)劑依(yī)然(rán)是敏(mǐn)感的(dí)。主(zhǔ)要(yào)的缺點(diǎn)是不同的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)會導(dǎo)致(zhì)同一(yī)樣(yàng)品的結果差異較(jiào)大(dà)，無可比性。

       某些初次(cì)接(jiē)觸(chù)比色法(fǎ)測定的(dí)研(yán)究者可(kě)能為(wéi)各(gè)種(zhǒng)比色法(fǎ)測(cè)出的結果(guǒ)並不一(yī)致(zhì)，感(gǎn)到迷惑，究竟該(gāi)相信哪種(zhǒng)方(fāng)法(fǎ)?由(yóu)於各(gè)種方法(fǎ)反應的(dí)基團(tuán)以(yǐ)及顯色(sè)基團不(bù)一，所(suǒ)以(yǐ)同時(shí)使用幾(jī)種方法對同(tóng)一樣品得出(chū)的(dí)樣品(pǐn)濃(nóng)度無可比性。例(lì)如(rú):Keller等(děng)測試(shì)人奶(nǎi)中的(dí)蛋(dàn)白(bái)，結果(guǒ)Lowry，BCA 測出的濃度明顯高(gāo)於(yú)Bradford，差異(yì)顯(xiǎn)著(zhù)。即使(shǐ)是測定同(tóng)一(yī)樣品，同(tóng)一種比色法(fǎ)選擇(zé)的(dí)標準樣品不(bù)一致(zhì)，測(cè)試(shì)後的(dí)濃(nóng)度(dù)也不一(yī)致(zhì)。如(rú)用Lowry測試(shì)細(xì)胞匀漿(jiāng)中的(dí)蛋白質，以(yǐ)BSA作(zuò)標準品(pǐn)，濃度(dù)1.34mg/ml，以(yǐ)a球蛋白作(zuò)標(biāo)準(zhǔn)品，濃度2.64mg/ml。因此(cǐ)，在選(xuǎn)擇比(bǐ)色法(fǎ)之前(qián)，是(shì)參照(zhào)要(yào)測試(shì)的樣本的(dí)化學(xué)構成，尋找(zhǎo)化(huà)學(xué)構(gòu)成類(lèi)似(sì)的(dí)標準蛋白作(zuò)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)。另(lìng)外，比(bǐ)色(sè)法定(dìng)量蛋白質，經常出現(xiàn)的問(wèn)題是(shì)樣品(pǐn)的吸(xī)光(guāng)值太(tài)低(dī)，導(dǎo)致測出的樣品(pǐn)濃度與實際的(dí)濃度(dù)差距(jù)較大。關鍵(jiàn)問題是，反應(yīng)後1011分(fēn)光光度計的(dí)重要(yào)配(pèi)件(jiàn)-- 比(bǐ)色(sè)杯(bēi)的顏(yán)色(sè)是(shì)有一(yī)定的半(bàn)衰期(qī)，所(suǒ)以每種比(bǐ)色法(fǎ)都(dū)列(liè)出(chū)了(liǎo)反應測試時間(jiān)，所有的樣(yàng)品(pǐn)(包括(kuò)標準樣品)，都必(bì)須(xū)在此時間(jiān)內(nèi)測試。時(shí)間過長(cháng)，得到的吸(xī)光值變小(xiǎo)，換(huàn)算的(dí)濃(nóng)度值(zhí)降低。除(chú)此，反應(yīng)溫度(dù)，溶液PH值等(děng)都是(shì)影響實(shí)驗(yàn)的重(zhòng)要(yào)原因。此外，非常(cháng)重(zhòng)要的(dí)是(shì)，是用塑(sù)料的(dí)比色法(fǎ)。避(bì)免使用石英或(huò)者(zhě)玻璃材質(zhì)的比色杯(bēi)，因(yīn)為反應後的(dí)顏(yán)色會讓(ràng)石(shí)英或(huò)者玻璃著(zhuó)色(sè)，導致樣品(pǐn)吸光(guāng)值不準(zhǔn)確。

        這種方(fāng)法是在280nm波(bō)長，直接測試蛋白。選(xuǎn)擇(zé)Warburg 公式，光度計可以(yǐ)直接顯示(shì)出(chū)樣(yàng)品(pǐn)的濃(nóng)度(dù)，或(huò)者是選擇相(xiāng)應的換算(suàn)方法，將吸光值轉換(huàn)為樣(yàng)品(pǐn)濃度。蛋白質(zhì)測定過(guò)程(chéng)非(fēi)常簡單，先(xiān)測試空(kōng)白液，然後直接測試蛋白質。由(yóu)於緩(huǎn)衝液(yè)中存(cún)在(zài)一(yī)些(xiē)雜(zá)質，一般要消(xiāo)除(chú)320nm 的"背景(jǐng)"信息，設(shè)定此功(gōng)能(néng)"開(kāi)"。與(yǔ)測試(shì)核酸類(lèi)似，要求(qiú)A280的吸(xī)光值至少大於(yú)0.1A，*的(dí)綫性(xìng)範圍在1.0-1.5 之間(jiān)。實驗中(zhōng)選擇Warburg 公式(shì)顯示(shì)樣品(pǐn)濃度時，發現(xiàn)讀(dú)數"漂(piāo)移(yí)"。這是一個正常(cháng)的現(xiàn)象。事實上(shàng)，隻(zhī)要觀(guān)察A280的(dí)吸光值(zhí)的變(biàn)化(huà)範圍不超(chāo)過1%，表明結果非常(cháng)穩(wěn)定(dìng)。漂移的(dí)原因是(shì)因為Warburg 公(gōng)式(shì)吸光值(zhí)換算(suàn)成濃(nóng)度，乘以一定的係數，隻要吸光(guāng)值(zhí)有(yǒu)少許改(gǎi)變，濃(nóng)度(dù)就(jiù)會被放(fàng)大(dà)，從而(ér)顯(xiǎn)得結果很不穩定(dìng)。蛋白質直接定量方法(fǎ)，適合測(cè)試較(jiào)純淨(jìng)，成分相對(duì)單(dān)一的蛋白質。紫(zǐ)外直(zhí)接(jiē)定(dìng)量(liáng)法相對於(yú)比色(sè)法(fǎ)來說(shuō)，速(sù)度快，操(cāo)作簡(jiǎn)單;但(dàn)是容(róng)易受到平行(háng)物質的(dí)幹擾，如DNA的(dí)幹擾;另(lìng)外敏(mǐn)感(gǎn)度(dù)低，要求蛋白的濃度較(jiào)高。