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超(chāo)微量(liáng)分(fēn)光光度計SMA5000是一類很(hěn)重要的生物(wù)實(shí)驗(yàn)室分析(xī)儀器,無(wú)論在(zài)物理學(xué)，化學，生(shēng)物(wù)學(xué)，醫學，材料學(xué)，環境科學(xué)等(děng)科學研究(jiū)領域 ,還是在化工，醫(yī)藥，環(huán)境(jìng)檢(jiǎn)測(cè)，冶(yě)金(jīn)等(děng)現(xiàn)代(dài)生產與管理(lǐ)部門(mén) ,紫(zǐ)外(wài)可(kě)見(jiàn)分光光度(dù)計督(dū)有廣(guǎng)泛而(ér)重(zhòng)要的應用(yòng)。超(chāo)微量分(fēn)光光度(dù)計SMA5000就(jiù)是(shì)利用(yòng)分光光度(dù)法對(duì)物質進(jìn)行定(dìng)量定性分析的(dí)儀器，常用於(yú)核(hé)酸，蛋白(bái)定(dìng)量以(yǐ)及細菌生(shēng)長濃度的(dí)定(dìng)量(liáng)。

核酸的定量(liáng)

核(hé)酸的(dí)定量(liáng)是超微量(liáng)分光(guāng)光度計使用頻(pín)率Gao的功(gōng)能。可以定量溶於(yú)緩衝液的(dí)寡核(hé)苷酸，單鏈，雙(shuāng)鏈(liàn)DNA，以及RNA。核(hé)酸的(dí)Gao吸(xī)收(shōu)峰的吸收(shōu)波長260 nm。每種(zhǒng)核(hé)酸的(dí)分子構(gòu)成不一(yī)，因(yīn)此其換算(suàn)係數不同(tóng)。定(dìng)量不(bù)同類型(xíng)的核酸(suān)，事先(xiān)要選(xuǎn)擇(zé)對應(yīng)的係數(shù)。如(rú)：1OD 的(dí)吸(xī)光值分別(bié)相(xiāng)當於(yú)50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的(dí)RNA，30μg/ml的Olig。測(cè)試後(hòu)的吸(xī)光(guāng)值經(jīng)過上述係數的換算，從(cóng)而(ér)得出相(xiāng)應的樣(yàng)品濃度。測(cè)試前，選(xuǎn)擇正(zhèng)確的程序(xù)，輸入原液(yè)和稀釋(shì)液的體積，爾後測試空白液和樣品液(yè)。然而，實(shí)驗(yàn)並非一(yī)帆(fān)風順(shùn)。讀(dú)數(shù)不穩定(dìng)可(kě)能(néng)是實驗者頭痛的問題(tí)。靈敏(mǐn)度(dù)越(yuè)高的儀(yí)器(qì)，表現出的吸光值漂(piāo)移(yí)越大。

事(shì)實上，分(fēn)光光度計的設(shè)計原(yuán)理和工(gōng)作原理，允許吸光(guāng)值(zhí)在一定(dìng)範圍內(nèi)變化(huà)，即(jí)儀(yí)器有一定的準確度和度。如斯(sī)達(dá)沃SMA5000超(chāo)微量分光光度計(jì)的準確(què)度≤1.0%（1A）。這樣多次(cì)測試的(dí)結果(guǒ)在(zài)均(jūn)值(zhí)1.0%左(zuǒ)右(yòu)之間變動(dòng)，都是正常的(dí)。另(lìng)外，還需(xū)考慮核酸本(běn)身物(wù)化性質和(hé)溶解核酸的緩(huǎn)衝(chōng)液的(dí)Da程(chéng)度pH值，離子濃(nóng)度等：在測試(shì)時(shí)，離子濃(nóng)度太高(gāo)，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂(piāo)移，因(yīn)此建議(yì)使用pH值(zhí)一定，離子濃(nóng)度較(jiào)低的(dí)緩(huǎn)衝液(yè)，如TE，可(kě)大(dà)大穩(wěn)定讀數。樣品(pǐn)的(dí)稀釋濃(nóng)度同(tóng)樣(yàng)是不可忽視的因素：由於樣(yàng)品(pǐn)中不(bù)可避(bì)免存(cún)在一些細小(xiǎo)的(dí)顆(kē)粒，尤其是核(hé)酸樣(yàng)品(pǐn)。這些小(xiǎo)顆(kē)粒(lì)的(dí)存在幹擾(rǎo)測試效果。為了減少(shǎo)顆粒對測試結果的影響，要(yào)求(qiú)核(hé)酸吸(xī)光(guāng)值(zhí)至少(shǎo)大於0.1A，吸(xī)光值(zhí)Hao在(zài)0.1-1.。在(zài)此範圍(wéi)內，顆粒(lì)的幹擾(rǎo)相對(duì)較(jiào)小，結果穩(wěn)定(dìng)。從而(ér)意(yì)味著(zhuó)樣品(pǐn)的(dí)濃度不能(néng)過低(dī)，或者(zhě)過(guò)高（超(chāo)過光度(dù)計(jì)的測(cè)試範(fàn)圍）。後是操作(zuò)因(yīn)素，如混(hùn)合要充(chōng)分，否(fǒu)則吸光(guāng)值太低(dī)，甚至出現(xiàn)負值；混合液不(bù)能存(cún)在氣(qì)泡，空白(bái)液無懸浮物(wù)，否(fǒu)則讀數漂移劇(jù)烈；必(bì)須使(shǐ)用(yòng)相(xiāng)同的比色杯(bēi)測試空白液(yè)和(hé)樣品，否(fǒu)則(zé)濃(nóng)度差(chà)異太大；換(huàn)算(suàn)係(xì)數(shù)和樣品(pǐn)濃度單位(wèi)選擇一致；不能采(cǎi)用窗(chuāng)口(kǒu)磨損(sǔn)的(dí)比色(sè)杯；樣品(pǐn)的體(tǐ)積必(bì)須(xū)達(dá)到比(bǐ)色杯要(yào)求(qiú)的(dí)小(xiǎo)體積等多(duō)個操(cāo)作(zuò)事項(xiàng)。

除(chú)了核(hé)酸(suān)濃度，超(chāo)微(wēi)量分光光度計(jì)同時顯(xiǎn)示(shì)幾個(gè)非常(cháng)重要的(dí)比值(zhí)表示樣品的(dí)純度，如(rú)A260/A280的比值，用於(yú)評(píng)估樣(yàng)品的(dí)純(chún)度，因(yīn)為蛋(dàn)白(bái)的吸收(shōu)峰(fēng)是280nm。純淨的(dí)樣(yàng)品(pǐn)，比值大(dà)於1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果(guǒ)比值(zhí)低於1.8 或者(zhě)2.0，表示(shì)存在(zài)蛋白質或者(zhě)酚(fēn)類物質(zhì)的影(yǐng)響。A230表(biǎo)示(shì)樣(yàng)品中(zhōng)存在一些汙染物，如碳水化合(hé)物(wù)，多肽，苯(běn)酚等(děng)，較純淨的(dí)核酸A260/A230的比值大(dà)於2.0。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其(qí)他幹擾(rǎo)因子。純樣品，A320一(yī)般是(shì)0。

蛋白(bái)質直接(jiē)定(dìng)量

這種方(fāng)法是在280nm波長(cháng)，直(zhí)接(jiē)測(cè)試(shì)蛋(dàn)白。選(xuǎn)擇Warburg 公式，超微量分光光(guāng)度計SMA5000可以直(zhí)接顯(xiǎn)示出(chū)樣(yàng)品的(dí)濃(nóng)度，或者是選擇相應(yīng)的(dí)換算方(fāng)法(fǎ)，將吸光(guāng)值轉換(huàn)為樣(yàng)品濃度。蛋白質測定過程(chéng)非常簡(jiǎn)單，先測試(shì)空白液，然後直接測試蛋(dàn)白質。由於緩(huǎn)衝液(yè)中(zhōng)存在一些雜質(zhì)，一般要(yào)消(xiāo)除(chú)320nm 的“背景(jǐng)”信息(xī)，設定(dìng)此功能“開”。與測(cè)試(shì)核酸(suān)類似，要(yào)求A280的吸(xī)光(guāng)值(zhí)至少大於0.1A，Jia的綫(xiàn)性範圍在1.0-1.5 之間。實驗(yàn)中選擇(zé)Warburg 公式(shì)顯示樣品(pǐn)濃(nóng)度時，發(fā)現讀(dú)數“漂移(yí)”。這是一個正常的現象。事實上，隻(zhī)要觀察A280的吸(xī)光值的(dí)變化範圍不(bù)超(chāo)過1%，表明結果非常穩(wěn)定(dìng)。漂(piāo)移(yí)的原因是因為(wéi)Warburg 公(gōng)式(shì)吸(xī)光值(zhí)換(huàn)算(suàn)成濃度(dù)，乘以(yǐ)一(yī)定(dìng)的係(xì)數(shù)，隻(zhī)要吸(xī)光值有(yǒu)少(shǎo)許改變(biàn)，濃(nóng)度就會被放大(dà)，從(cóng)而顯得結果很(hěn)不穩(wěn)定(dìng)。蛋(dàn)白質直(zhí)接(jiē)定(dìng)量方法，適合測(cè)試(shì)較純淨，成(chéng)分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外(wài)直(zhí)接(jiē)定量(liáng)法相對(duì)於(yú)比色(sè)法(fǎ)來(lái)說(shuō)，速度快(kuài)，操(cāo)作(zuò)簡單(dān)；但是容易受(shòu)到(dào)平行物(wù)質的幹(gān)擾(rǎo)，如DNA的幹擾(rǎo)；另(lìng)外(wài)敏(mǐn)感(gǎn)度低，要求蛋(dàn)白的濃度(dù)較(jiào)高(gāo)。

比色(sè)法蛋白(bái)質定(dìng)量(liáng)

蛋白質通(tōng)常(cháng)是多(duō)種蛋白質的化(huà)合物，比色法(fǎ)測(cè)定(dìng)的(dí)基礎是蛋白質構成成(chéng)分：氨(ān)基酸（如酪氨酸，絲(sī)氨(ān)酸）與外加的顯(xiǎn)色(sè)基團(tuán)或者染料(liào)反(fǎn)應(yīng)，產(chǎn)生有色物質。有(yǒu)色(sè)物(wù)質的濃度與(yǔ)蛋(dàn)白(bái)質反應的(dí)氨基酸數(shù)目(mù)直接相關，從(cóng)而反應蛋(dàn)白質濃(nóng)度(dù)。

比色(sè)方(fāng)法(fǎ)一(yī)般有(yǒu)BCA，Bradford，Lowry 等(děng)幾(jī)種方法。

Lowry 法：以早(zǎo)期的Biuret 反應為基(jī)礎(chǔ)，並有(yǒu)所改進。蛋(dàn)白(bái)質與(yǔ)Cu2 反(fǎn)應，產生(shēng)藍色的反應物。但(dàn)是(shì)與(yǔ)Biuret 相比，Lowry 法敏感性(xìng)更高。缺點是需(xū)要順序加(jiā)入(rù)幾種(zhǒng)不同(tóng)的反應(yīng)試(shì)劑；反(fǎn)應需要的時間較(jiào)長；容易受到非蛋(dàn)白(bái)物(wù)質(zhì)的(dí)影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等(děng)物質的蛋(dàn)白不適(shì)合(hé)此(cǐ)種(zhǒng)方法。

BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：這是(shì)一種較(jiào)新(xīn)的，更(gēng)敏(mǐn)感(gǎn)的蛋白測試(shì)法。要(yào)分析(xī)的(dí)蛋白(bái)在(zài)鹼性溶液裏與(yǔ)Cu2 反(fǎn)應產生Cu ，後者與BCA形(xíng)成(chéng)螯合物，形(xíng)成(chéng)紫色化合物(wù)，吸(xī)收(shōu)峰在562nm波(bō)長。此化(huà)合物(wù)與蛋(dàn)白(bái)濃(nóng)度(dù)的綫性關(guān)係(xì)*，反(fǎn)應後(hòu)形成的化(huà)合物非(fēi)常(cháng)穩定(dìng)。相(xiāng)對於(yú)Lowry法，操(cāo)作(zuò)簡單，敏感(gǎn)度高。但(dàn)是(shì)與(yǔ)Lowry法相(xiāng)似的(dí)是容易受到蛋(dàn)白質之間以及去(qù)汙(wū)劑的(dí)幹擾。

Bradford 法：這種(zhǒng)方法的(dí)原(yuán)理(lǐ)是蛋白(bái)質與(yǔ)考(kǎo)馬斯亮蘭結(jié)合(hé)反應，產生(shēng)的有色化合物吸(xī)收峰595nm。其大的特點(diǎn)是，敏(mǐn)感(gǎn)度好(hǎo)，是Lowry 和(hé)BCA 兩(liǎng)種(zhǒng)測試方(fāng)法的2 倍；操(cāo)作(zuò)更(gēng)簡(jiǎn)單(dān)，速度更快(kuài)；隻需要一種(zhǒng)反應試劑(jì)；化合物(wù)可以(yǐ)穩定(dìng)1小時，方便(biàn)結(jié)果(guǒ)；而且(qiě)與(yǔ)一(yī)係列(liè)幹擾Lowry，BCA 反應的還(huán)原劑(jì)（如DTT，巰(qiú)基(jī)乙醇）相容。但(dàn)是(shì)對於去(qù)汙劑(jì)依然是(shì)敏(mǐn)感的。主(zhǔ)要的(dí)缺(quē)點(diǎn)是不(bù)同的標準品會(huì)導致同(tóng)一樣品(pǐn)的結(jié)果(guǒ)差異(yì)較大(dà)，無可比性(xìng)。

某些初次接觸(chù)比色法(fǎ)測(cè)定(dìng)的研究者可(kě)能為各種(zhǒng)比(bǐ)色(sè)法測出(chū)的(dí)結果(guǒ)並不(bù)一致，感到迷(mí)惑(huò)，究(jiū)竟該(gāi)相信哪種方(fāng)法(fǎ)？由於(yú)各種方(fāng)法反應的(dí)基(jī)團以及顯色(sè)基(jī)團(tuán)不一，所(suǒ)以同(tóng)時使用幾種(zhǒng)方(fāng)法(fǎ)對同(tóng)一樣品得出的(dí)樣品濃度無可比(bǐ)性(xìng)。例(lì)如：Keller等測試(shì)人(rén)奶中(zhōng)的蛋白，結(jié)果Lowry，BCA 測(cè)出(chū)的(dí)濃(nóng)度(dù)明(míng)顯高於Bradford，差異顯(xiǎn)著(zhù)。即(jí)使是測定(dìng)同(tóng)一(yī)樣品，同一種比色(sè)法(fǎ)選擇(zé)的標(biāo)準樣(yàng)品不一致，測試(shì)後的(dí)濃度(dù)也(yě)不一致。如(rú)用Lowry測(cè)試(shì)細胞(bāo)匀漿中的(dí)蛋(dàn)白(bái)質，以(yǐ)BSA作標準品，濃度1.34mg/ml，以(yǐ)a球(qiú)蛋白(bái)作標準品，濃度2.64mg/ml。因(yīn)此(cǐ)，在(zài)選(xuǎn)擇比色法之(zhī)前(qián)，Hao是參照(zhào)要測(cè)試(shì)的樣本(běn)的化(huà)學(xué)構成(chéng)，尋(xún)找化學構成(chéng)類似的(dí)標準蛋(dàn)白作標準品(pǐn)。另外，比(bǐ)色(sè)法定量(liáng)蛋白(bái)質，經常(cháng)出現(xiàn)的問題是樣(yàng)品(pǐn)的吸(xī)光值太低，導致(zhì)測出的(dí)樣(yàng)品濃度(dù)與(yǔ)實際(jì)的濃(nóng)度(dù)差距(jù)較大。關鍵(jiàn)問題(tí)是，反(fǎn)應後(hòu)1011分光光(guāng)度計(jì)的重(zhòng)要(yào)配件—— 比色(sè)杯(bēi)的(dí)顏色是(shì)有(yǒu)一定(dìng)的半衰期，所以(yǐ)每種比(bǐ)色(sè)法都列出(chū)了反(fǎn)應(yīng)測(cè)試(shì)時間(jiān)，所(suǒ)有的樣品（包括(kuò)標準樣品），都必(bì)須在(zài)此(cǐ)時(shí)間內測(cè)試。時間過長，得到(dào)的(dí)吸光(guāng)值變(biàn)小，換算(suàn)的濃(nóng)度(dù)值降低。除此(cǐ)，反應溫度(dù)，溶(róng)液PH值(zhí)等(děng)都(dū)是影響實驗(yàn)的(dí)重要(yào)原因(yīn)。此外，非常重(zhòng)要的(dí)是，Hao是用塑料(liào)的(dí)比色(sè)法(fǎ)。避(bì)免(miǎn)使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色(sè)杯，因為(wéi)反(fǎn)應(yīng)後的(dí)顏(yán)色會讓(ràng)石英(yīng)或(huò)者(zhě)玻(bō)璃著(zhuó)色，導(dǎo)致樣(yàng)品吸光(guāng)值不(bù)準確(què)。

斯達沃(wò)SMA5000

實(shí)驗室(shì)確定細菌生長密度(dù)和生長期(qī)，多(duō)根據經驗(yàn)和目(mù)測(cè)推斷細菌的生(shēng)長(cháng)密(mì)度。在遇到要(yào)求(qiú)較高的實驗，需(xū)要采(cǎi)用分光(guāng)光度(dù)計(jì)準(zhǔn)確測定(dìng)細菌細胞密度(dù)。斯達沃SMA5000是追(zhuī)蹤(zōng)液體(tǐ)培養物中微生物生長(cháng)的標準(zhǔn)方(fāng)法。以未(wèi)加菌液(yè)的(dí)培養液(yè)作為空白(bái)液，之後(hòu)定(dìng)量(liáng)培(péi)養(yǎng)後的(dí)含菌培養液(yè)。為了(liǎo)保(bǎo)證正確操作，必須(xū)針對(duì)每種微(wēi)生物(wù)和(hé)每(měi)台儀(yí)器(qì)用顯微(wēi)鏡進行(háng)細(xì)胞計數(shù)，做出校(xiào)正(zhèng)曲綫。實驗中偶(ǒu)爾會(huì)出現菌液的(dí)OD值出(chū)現負(fù)值，原因是(shì)采用了顯色(sè)的(dí)培(péi)養基，即細(xì)菌(jūn)培養一段(duàn)時間後，與(yǔ)培養(yǎng)基反(fǎn)應，發生(shēng)變色反應。另外，需(xū)注意(yì)的是(shì)，測(cè)試的樣(yàng)品不能(néng)離(lí)心(xīn)，保持(chí)細菌懸(xuán)浮(fú)狀(zhuàng)態。